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ISTRUZIONI. "AmpliSense HCV-genotype-FL" AmpliSense

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1 ISTRUZIONI per l'uso di un kit di reagenti per la rilevazione e la differenziazione dei genotipi del virus dell'epatite C (HCV) in materiale clinico mediante il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) con ibridazione in tempo reale - rilevazione della fluorescenza AmpliSense HCV genotipo-FL AmpliSense di scienza "Istituto centrale di ricerca di epidemiologia", Federazione Russa,, Mosca, via Novogireevskaya, 3a

2 INDICE ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI. 3 SCOPO. 3 PRINCIPIO DEL METODO. 3 FORMATI E FORME DI EMISSIONE DEL KIT DEL REATTIVO. 5 CARATTERISTICHE ANALITICHE. 5 PRECAUZIONI. 6 MATERIALI E ATTREZZATURE AGGIUNTIVI. 7 COLLEGAMENTO, TRASPORTO E STOCCAGGIO DEL MATERIALE INDICATO. 9 FORMATO FRATTO COMPOSIZIONE CONDUCENTE PCR RICERCA RNA ESTRAZIONE DA CAMPIONI DI RICERCA CONDUZIONE DELLA REAZIONE DI TRASCRIZIONE INVERSA A. Preparare le provette per le trascrizioni inverse. Preparazione delle provette di amplificazione utilizzando il kit di reagenti del kit PCR Variante FRT-G A2. Preparazione di provette per l'amplificazione utilizzando il kit di reagenti PCR-kit (opzione FRT-G) B. Amplificazione conduttiva con sistemi di rilevamento in tempo reale ANALISI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEI TERMINI DI CONNESSIONE VALIDITÀ, TRASPORTO E STOCCAGGIO RIBO-Sorb "APPENDICE 2. ESTRAZIONE DELL'RNA UTILIZZANDO IL REIBENTE SET DI SIMBOLI" RIBO-prep "UTILIZZATI NEL PRODOTTO DI STAMPA x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 2 di 32

3 ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI In questa istruzione vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni e annotazioni: DNA acido deossirubonucleico cdna complementare DNA RNA acido ribonucleico DALLA trascrizione inversa Campione di controllo interno EKR Campione di controllo negativo JCE Campione di controllo positivo OCR K + - controllo positivo PCR K - controllo negativo PCR OK - negativo controllo di estrazione PCR polimerasi reazione a catena FBUN Istituto centrale di ricerca di epidemiologia Rospotrebnadzor HCV FRT APPUNTAMENTO Istituzioni di bilancio federale "Istituto centrale di ricerca epidemiologica" del Servizio federale per la protezione dei diritti dei consumatori e il benessere umano Rilevazione fluorescente del virus dell'epatite C in "Real Time" Il kit di reagenti per genotipo HCV AmpliSense HCV è progettato per identificare e differenziare i genotipi del virus epatite C (HCV) in materiale clinico mediante il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) con rilevazione di fluorescenza-ibridazione in modalità "tempo reale". La determinazione dei genotipi HCV 1a, 1b, 2, 3a, 4 viene effettuata utilizzando la variante "PCR kit" FRT-g1-4; I genotipi HCVa 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6 sono determinati utilizzando la variante "PCR kit" FRT-g1-6. Si consiglia di utilizzare questo kit di reagenti dopo il rilevamento dell'HCV RNA nei campioni in esame utilizzando kit di reagenti progettati per la determinazione qualitativa e quantitativa dell'RNA del virus dell'epatite C (ad esempio, AmpliSense HCV-FL, utilizzando il rilevamento della fluorescenza dell'ibridazione o AmpliSense HCV- EPh "utilizzando il rilevamento elettroforetico di prodotti di amplificazione (prodotto da FBUN TsNII Epidemiology Rospotrebnadzor)). ATTENZIONE! I risultati degli studi sulla PCR sono presi in considerazione nella diagnosi completa della malattia 1. PRINCIPIO DEL METODO 1 In conformità con la Direttiva 98/79 / CE dell'Unione Europea. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 3 di 32

4 Il principio del test si basa sull'estrazione dell'RNA dal plasma sanguigno insieme a un campione di controllo interno ricombinante (ASD), eseguendo una reazione di trascrizione inversa dell'RNA e dell'amplificazione PCR del CDna con rilevazione dell'ibridizzazione-fluorescenza in "tempo reale". Per escludere risultati falsi negativi, VKO è stato introdotto nello studio, che consente di controllare tutte le fasi dell'analisi e valutare l'effetto degli inibitori della PCR sui risultati dello studio. La determinazione del genotipo HCV di un campione viene effettuata in diverse provette, in ciascuna provetta sono differenziati due genotipi HCV o un genotipo HCV e VKO. Il kit è progettato per strumenti con due o più canali di rilevamento della fluorescenza. La tabella mostra i canali mediante i quali vengono rilevati i genotipi HCV per ciascuna miscela di reazione. Miscela di reazione 1b / 3a 1a / 2 BKO / 4 5a / 6 Genotipi rilevabili HCV a 2 canali FAM / Verde 1b 1a CTP 5À JOE / HEX / Giallo / Cy3 3a La versione FRT-g1-6 è inclusa nel kit PCR. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 4 di 32

5 FORMATI E FORME DI KIT DI REAGENTI RILASCIATI Il kit di reagenti è disponibile in 1 formato: formato FRT Il kit di reagenti è disponibile in 7 kit di configurazione: Modulo 1 include l'opzione 50 kit reagenti RIBO-sorb, l'opzione REVERTA-L 50, il kit PCR Variante FRT-g1-4. Il modulo 2 include l'opzione 50 "kit reagenti RIBO", l'opzione "REVERT-L" 50, l'opzione "kit PCR" FRT-g1-4. Il modulo 3 include l'opzione del kit di reagenti "kit PCR" FRT-g1-4. Il modulo 4 include i kit di reagenti "RIBO-sorb", l'opzione 50, "REVERT-L", l'opzione 50, l'opzione "PCR kit" FRT-g1-6. Il modulo 5 comprende l'opzione 50 "kit reagenti RIBO", l'opzione "REVERT-L" 50, l'opzione "kit PCR" FRT-g1-6. Il modulo 6 include l'opzione del kit di reagenti "kit PCR" FRT-g1-6. Il modulo 7 include kit di reagenti alla rinfusa, confezionati in reagenti separati, con l'etichettatura dei reagenti sul loro imballaggio alla rinfusa. Le forme di completamento 1, 2, 3 sono progettate per determinare i genotipi 1a, 1b, 2, 3a, 4 del virus dell'epatite C. Le forme di completamento 4, 5, 6 hanno lo scopo di determinare i genotipi 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6 del virus dell'epatite C. I moduli di completamento 1, 2, 4, 5 sono progettati per studi PCR completi, inclusa l'estrazione di RNA da materiale clinico, la trascrizione inversa dell'RNA e l'amplificazione PCR di CDna con rilevazione di ibridazione-fluorescenza in "tempo reale". Le forme di raggruppamento 3 e 6 sono intese per eseguire l'amplificazione PCR di cdna con rilevamento di ibridizzazione-fluorescenza nella modalità "tempo reale". Per condurre uno studio completo sulla PCR, è necessario utilizzare i kit di reagenti prodotti dall'Istituto di ricerca di Epidemiologia di Rospotrebnadzor per l'estrazione di RNA (kit di reagenti "RIBO sorb" o "RIBO-prep") e eseguire la reazione di trascrizione inversa (kit di reagenti REVERTA-L). La forma del prelievo 7 è intesa per scopi di produzione per l'etichettatura successiva nella lingua del cliente e per il prelievo sui set. ATTENZIONE! L'utilizzo del set di moduli 7 viene effettuato solo in conformità con i regolamenti approvati dall'Istituto centrale di ricerca epidemiologica di Rospotrebnadzor. CARATTERISTICHE ANALITICHE 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 5 di 32

6 Sensibilità analitica Volume di estrazione, μl Kit di estrazione RNA / DNA 100 "RIBO-sorb" 100 "RIBO-prep" Kit di amplificazione e rilevamento "PCR kit" versione FRT-g1-4, opzione "PCR kit" FRT- g1-6 versione "PCR kit" FRT-g1-4, versione "PCR kit" FRT-g1-6 Sensibilità analitica, UI / ml 2,5x10 3 5x10 3 Specificità analitica Una valutazione della specificità analitica del kit di reagenti non ha mostrato cross-reazioni tra genotipi 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a e 6 del virus dell'epatite C utilizzando ricombinanti altamente concentrati i campioni di controllo positivi covarianti e campioni di plasma sanguigno corrispondente a genotipi di HCV. PRECAUZIONI Il lavoro dovrebbe essere condotto in laboratorio per eseguire studi di materiale clinico molecolare (PCR) per la presenza di patogeni infettivi, seguendo le regole sanitarie ed epidemiche della joint venture "Sicurezza del lavoro con microrganismi della III IV patogenicità (rischio) e patogeni di malattie parassitarie", SanPiN "Sanitario - requisiti epidemiologici per il trattamento dei rifiuti medici "e linee guida MU" Organizzazione di laboratori che utilizzano metodi di amplificazione n acidi kleinovyh Lavorando con materiale contenente microrganismi gruppi patogenicità I IV". Durante il lavoro, rispettare sempre i seguenti requisiti: - I campioni testati devono essere considerati infettivi, organizzare il lavoro e lo stoccaggio in accordo con la joint venture "Sicurezza del lavoro con i microrganismi dei gruppi III III di patogenicità (pericolo) e patogeni delle malattie parassitarie". - Pulire e disinfettare campioni o reagenti versati utilizzando disinfettanti conformemente alla Joint Venture "Sicurezza del lavoro con microrganismi dei gruppi di patogenicità III III (pericolo) e patogeni delle malattie parassitarie". - Il processo di laboratorio deve essere unidirezionale. L'analisi viene eseguita in 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p.6 di 32

7 stanze separate (zone). Il lavoro dovrebbe iniziare nella zona di selezione, continuare nella zona di amplificazione e rilevamento. Non restituire campioni, apparecchiature e reagenti nell'area in cui è stata effettuata la fase precedente del processo. - Rimuovere i reagenti non utilizzati in conformità con SanPiN "Requisiti sanitari-epidemiologici per la gestione dei rifiuti medici". ATTENZIONE! Quando si rimuovono i rifiuti dopo l'amplificazione (provette contenenti prodotti PCR), è inaccettabile aprire le provette e cospargere il contenuto, poiché ciò potrebbe causare la contaminazione dell'area del laboratorio, delle apparecchiature e dei reagenti con prodotti PCR. Utilizzare il kit esclusivamente per lo scopo previsto, in base a questo manuale. Permettere solo al personale appositamente addestrato di lavorare con il kit. Non usare il kit dopo la data di scadenza. Utilizzare guanti monouso, camici da laboratorio, proteggere gli occhi mentre si lavora con campioni e reagenti. Lavarsi accuratamente le mani dopo il lavoro. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. Al contatto, sciacquare immediatamente la zona interessata con acqua e consultare un medico. Le schede di sicurezza dei materiali (scheda di sicurezza dei materiali MSDS) sono disponibili su richiesta. MATERIALI AGGIUNTIVI E ZONA DELL'APPARECCHIATURA 1. Estrazione di RNA da materiale clinico 1. Kit di reagenti per l'isolamento RNA / DNA "Ribo-sorb" (TU), "RIBO prep" (TU) o altri consigliati dall'Istituto centrale di ricerca epidemiologica di Rospotrebnadzor FBUN per lavorare con il set completo 3, scatola laminare. 3. Vortice. 4. Microcentrifuga per tubi di tipo Eppendorf fino a 12 migliaia di g. 5. Termostato per provette di tipo Eppendorf da 25 a 100 C. 6. Dispensatori automatici di volume variabile (da 5 a 50 μl, da 20 a 200 μl e da 100 a 1000 μl). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 7 di 32

8 7. Provette monouso in polipropilene monouso o con chiusura da 1,5 ml. 8. Puntali monouso con filtro fino a 100 μl, fino a 200 μl e fino a 1000 μl in treppiedi. 9. Aspiratore medico a vuoto con una fiaschetta per rimuovere il surnatante. 10. Puntali monouso fino a 200 μl per treppiede. 11. treppiedi per tubi da 1,5 ml. 12. Frigorifero da 2 a 8 С. 13. Vestaglia, cappelli, scarpe e guanti monouso separati secondo MU Capacità con soluzione disinfettante. ZONA 2. Esecuzione della reazione di trascrizione inversa e amplificazione in modalità "tempo reale" 1. Kit di reagenti per l'esecuzione della reazione di trascrizione inversa "REVERTA-L" (TU) quando si lavora con i moduli di configurazione 3, Scatola di mezzo di aria abissale (scatola PCR). 3. Centrifuga / vortice. 4. Distributori automatici di volume variabile (da 5 a 50 μl e da 20 a 200 μl). 5. Puntali monouso con filtro fino a 100 μl e fino a 200 μl in treppiedi. 6. Treppiedi per provette da 0,5 ml o 0,2 ml o 0,1 ml (in base al tipo di tubi utilizzati). 7. Frigorifero da 2 a 8 С con congelatore non superiore a meno 16 С. 8. Camice, cappelli, scarpe e guanti monouso separati secondo MU Capacità di scarico delle punte. Quando si esegue una reazione di trascrizione inversa usando "REVERET-L": 10. Provette monouso in polipropilene con un volume di 0,2 ml o 0,5 ml (a seconda del modello di termostato o amplificatore utilizzato, in cui viene eseguita la reazione di trascrizione inversa). 11. Termostato per tubi di tipo Eppendorf da 25 a 100 C o un amplificatore programmabile (ad esempio, Terzik (DNA Technology, Russia), Gradient Palm Cycler (Corbett Research, Australia), GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems, Stati Uniti d'America)). 12. Quando si imposta la reazione di trascrizione inversa per meno di 10 studi 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p 8 di 32

Dispensatore automatico a 9 campioni di volume variabile (da 0,5 a 10 μl). 13. Quando si imposta la reazione di trascrizione inversa per meno di 10 campioni studiati, punte monouso con un filtro fino a 10 μl per treppiede. Quando si lavora con il "kit PCR": 14. Amplificatori rotativi programmabili (ad esempio, Rotor-Gene 3000 o 6000 (Corbett Research, Australia), Rotor-Gene Q (Qiagen, Germania)) o amplificatori a tavoletta (ad esempio, icycler IQ5 (Bio-Rad, USA)), o amplificabile SmartCycler II (Cefeide, Stati Uniti d'America), o Mx3000P, Mx3005P (Stratagene, USA) e l'Istituto di ricerca consigliato FBUN di Epidemiologia nelle linee guida per l'uso di questo kit di reagenti). 15. Provette monouso in polipropilene per PCR: a) tubi a parete sottile per PCR con un volume di 0,2 ml con cappuccio convesso (non stirato o spellato) quando si utilizza un dispositivo tablet; b) provette per PCR da 0,2 ml a parete sottile con tappo piano (non stirato) o provette con volume di 0,1 ml utilizzando un dispositivo rotativo. c) Provette PCR da 0,025 ml (Cepheid, USA) utilizzando uno strumento SmartCycler II (Cepheid, USA). 16. Treppiede con etichetta (quando si utilizzano dispositivi tablet). 17. Provette monouso in polipropilene per PCR (tappo piatto, non standard) per 0,5 ml 18. Centrifuga e provetta per rack (Cepheid, USA) utilizzando SmartCycler II (Cepheid, USA). Raccolta dei campioni, il trasporto e lo stoccaggio del materiale di prova prima dell'inizio dei lavori dovrebbero avere familiarità con le linee guida del 'prendere, trasporto, deposito di materiale clinico per PTsRdiagnostiki "sviluppato da FSIS CRIE Rospotrebnadzor, Mosca, 2008 Per gli studi di PCR utilizzando plasma sanguigno periferico. Per ottenere il plasma, il sangue viene immesso in una provetta con una soluzione di EDTA al 3% alla velocità di 20: 1 (20 parti di sangue per 1 parte di EDTA). Girare la provetta chiusa con sangue diverse volte. Entro 6 ore dal momento della raccolta del sangue, il plasma deve essere raccolto e trasferito in una nuova provetta. Per fare questo, il tubo con sangue viene centrifugato per 20 minuti a g, dopo di che il plasma viene prelevato e trasferito a un 2x monouso separato (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p 9 di 32

10 provetta. Il plasma può essere conservato per non più di 3 giorni a una temperatura compresa tra 2 e 8 ° C e per un lungo periodo a una temperatura non superiore a meno 68 C. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p.

11 FORMATO FORMATO FRT FRT COMPOSIZIONE Reagente kit "ribo-sorb" per 50 kit di reagenti per l'estrazione di RNA / DNA da materiale clinico comprende: Descrizione del reagente Volume, ml di soluzione di lisi Max Una soluzione per il lavaggio una soluzione per il lavaggio 3 Una soluzione per il lavaggio 5 1 flaconcino fiala 50 1 flaconcino 20 1 flaconcino Sorbente Sospensione bianca 1.25 1 tubo Tampone RNA 0,5 5 provette Il kit reagenti è progettato per isolare l'RNA / DNA da 50 campioni, inclusi i controlli. Incluso nella composizione del set completo 1 e 4. Kit di reagenti "RIBO-prep" versione 50 kit di reagenti per l'isolamento di RNA / DNA da materiale clinico comprende: Reagente Descrizione Volume, ml Quantità Soluzione per lisi Soluzione per precipitazione Soluzione per lavaggio 3 Soluzione per lavaggio 4 tampone di RNA Flaconcino colorato di blu trasparente 20 1 flaconcino 25 1 flaconcino 10 1 flaconcino 1.2 4 provette Il kit di reagenti è progettato per l'isolamento di RNA / DNA da 50 campioni, inclusi i controlli. Incluso nella forma del prelievo 2 e 5. Opzione del kit del reagente Reverse-L 50 kit di reagenti per 3 Quando si conserva una soluzione di lisi, una soluzione di lisi e una soluzione di lavaggio 1 a una temperatura compresa tra 2 e 8 C, si può formare un precipitato sotto forma di cristalli. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 11 di 32

12 FRT FORMAT per la produzione di cdna su un modello di RNA include: RT-G-mix-1 RT-mix Revertase (MMlv) DNA buffer Reagente Descrizione Volume, ml Q.tà 0,01 5 provette 0,125 5 provette 0,03 1 provetta 1, 2 1 tubo Il kit di reagenti versione 50 è progettato per eseguire 60 reazioni di trascrizione inversa, inclusi i controlli. Kit di reagenti "Kit PCR" La versione FRT-g1-4 del kit per l'amplificazione PCR dei genotipi di CDna (1a, 1b, 2, 3a, 4) di HCV con rilevamento di ibridazione in tempo reale include: PCR mix-1- Genotipi FRT HCV 1b / 3a PCR mix-1-FRT HCV genotipi 1a / 2 PCR mix-1-FRT HCV EKO / genotipo 4 Reagente Descrizione Volume, ml Conteggio RT-PCR mix-2-FEP / FRT Polimerasi (TaqF) HCV cdna Genotipi PKO 1b / 3a HCV cdna Genotipi PKO 1a / 2 PKO cdna HCV CTP / genotipo 4 TE buffer 0.6 1 tubo 0.6 1 tubo 0.6 1 tubo 0.3 3 tubo 0.03 3 provette 0,2 1 provetta 0,2 1 provetta 0,2 1 provetta 0,5 1 provetta K Il kit di reagenti è progettato per 55 test (165 reazioni di amplificazione), inclusi i controlli. Incluso nel set di configurazioni 1, 2 e 3. I campioni di selezione sono collegati al kit di reagenti: 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 12 di 32

13 FRT FORMAT Reagente Descrizione Volume, ml Quantità di OKO VKO STI-248-rec 0,5 1 tubo 0,5 1 tubo Kit di prova "Kit PCR" versione FRT-g1-6 kit per l'amplificazione PCR dei genotipi cdna ( 1a, 1b, 2, 3a, 4, 5a, 6) HCV con rilevazione in tempo reale di ibridizzazione-fluorescenza comprende: Descrizione del reagente Volume, ml Quantità di mix-1-FRT HCV genotipi PCR 1b / 3a mix- 1 1-FRT genotipi HCV 1a / 2 miscela PCR-1-FRT HCV EKR / genotipi 4 genotipi di HCV PCR mix-1-FRT 5a / 6 RT-PCR-miscela-2-FEP / FRT polimerasi (TaqF) FFP cDNA HCV genotipi 1b / 3a PKO cdna genotipi HCV 1a / 2 PKO cdna HCV EKO / genotipo 4 PKO cdn Genotipi HCV 5a / 6 TE-buffer 0,6 1 provetta 0,6 1 provetta 0,6 1 provetta 0,6 1 provetta 0,3 4 provette 0,03 4 provette 0,2 1 provetta 0,2 1 provetta 0, 2 1 tubo 0,2 1 tubo 0,5 1 tubo Il kit di reagenti è progettato per 55 test (220 reazioni di amplificazione), inclusi i controlli. Incluso nel set di configurazione 4, 5 e 6. Al kit di reagenti collegato campioni di controllo del livello di selezione: 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 13 di 32

14 FRT FORMAT Reagente Descrizione Volume, ml Quantità di OKO VKO STI-248-rec 0,5 1 provetta 0,5 1 provetta CONDUCENTE DELLA RICERCA PCR Lo studio PCR consiste nei seguenti passaggi: Estrazione di RNA dai campioni in esame. Condurre la reazione di trascrizione inversa. Amplificazione con ibridazione-rilevazione della fluorescenza in modalità "tempo reale". Analisi e interpretazione dei risultati. I dettagli della procedura di analisi si basa sul tipo di apparecchiatura utilizzata è presentato in "Linee guida per l'utilizzo di un kit di reagenti per la determinazione e la differenziazione dei genotipi virali di epatite C (HCV) in campioni clinici, mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) con rilevazione ibridazione fluorescenza" AmpliSense HCV-genotipo-FL ", sviluppato dall'Istituto centrale di ricerca epidemiologica di Rospotrebnadzor. ESTRAZIONE DI RNA DAGLI ESEMPLIFICATORI PROVENIENTI! Quando si lavora con RNA, è necessario utilizzare solo materiali di consumo monouso in plastica con contrassegni speciali "RNasefree", "DNase-free". RNA kit di reagenti estrazione impiegati raccomandati FBUN CRI Epidemiology: utilizzando la procedura operativa kit reagenti "ribo-sorbo", vedi allegato 1 "Estrazione di RNA utilizzando un kit di reagenti" ribo-sorb ".. quando si utilizza il kit di reagenti per la preparazione RIBO, consultare la procedura riportata nell'appendice 2 "Estrazione dell'RNA usando il kit di reagenti RIBO-prep". ATTENZIONE! La preparazione risultante di RNA non è soggetta a stoccaggio, la reazione è inversa 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p 14 di 32

15 La trascrizione di FORT FRT deve essere eseguita immediatamente dopo aver ricevuto la sonda RNA. CONDUZIONE DELLE REAZIONI DI TRASCRIZIONE INVERSA Il volume totale della miscela di reazione è di 20 μl, incluso il volume del campione di RNA 10 μl. ATTENZIONE! Quando si lavora con RNA, è necessario utilizzare solo materiali di consumo monouso in plastica con contrassegni speciali "RNasefree", "DNase-free". A. Preparazione delle provette per la trascrizione inversa Per l'inserimento di reagenti e campioni di RNA in provette, vengono utilizzati puntali monouso con filtri. ATTENZIONE! I componenti della miscela di reazione devono essere miscelati immediatamente prima della reazione di trascrizione inversa. 1. Prima di iniziare a lavorare, scongelare, mescolare accuratamente su RT-mix vortex e RT-G-mix-1. Scaricare le goccioline dai tappi delle provette. 2. Selezionare il numero richiesto di provette con un volume di 0,2 o 0,5 ml (a seconda del modello di termostato o amplificatore utilizzato) per la reazione di trascrizione inversa, tenendo conto del numero di campioni di test e di controllo (un controllo di estrazione (OK)). Etichettare le provette. 3. Quando si esegue la trascrizione inversa dei campioni: a) Preparare la miscela di reazione per 12 reazioni. Per fare ciò, aggiungere 5 μl di RT-G-mix-1 alla provetta con RT-mix, miscelare accuratamente su un vortice e far precipitare le gocce dal cappuccio del tubo. b) Aggiungere 6 μl di revertasi (MMlv) alla soluzione risultante, pipettare 5 volte, mescolare su un vortice. Drenare le goccioline dal coperchio della provetta con una breve centrifugazione. 4. Quando si esegue la trascrizione inversa di meno di 10 campioni: Per preparare la miscela di reazione, è necessario miscelare i reagenti per 1 reazione nell'ordine seguente nel seguente ordine: 10 μl RT-mix, 0,4 μl RT-G-mix-1 e 0, 5 μl di revertasi (MMlv) (vedere anche Tabella 1). Quando aggiunto a una miscela di RT-G-mix-1 e revertase (MMlv), pipettare ciascun reagente almeno 5 volte. Mescolare accuratamente la miscela su un vortice e far precipitare le goccioline dal cappuccio del tubo. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 15 di 32

16 FRT FORMAT ATTENZIONE! Revertase (MMlv) è sensibile al calore! Non lasciarlo a temperatura ambiente per molto tempo! Subito dopo l'uso, metti il ​​frigorifero nel congelatore! La quantità di reagente per reazione (μl) Il numero di campioni clinici Lo schema di preparazione della miscela di reazione 10.00 0.4 0.5 RT-mix RT-G-mix-1 Revertase (MMlv), 4 3,, 8 3,, 2 4,, 6 4,, 0 5.0 5. Aggiungere 10 μl della miscela di reazione preparata alle provette preparate. Tabella 1 6. Aggiungere 10 μl di campioni di RNA isolati dai campioni clinici e di controllo alle provette finite secondo l'etichettatura. Agitare delicatamente su vortex e far precipitare le gocce dal cappuccio della fiala. ATTENZIONE! Quando si aggiungono campioni di RNA isolati usando il kit di reagenti RIBO-sorb, è necessario evitare l'ingresso del sorbente nella miscela di reazione. B. Esecuzione della reazione di trascrizione inversa 1. Posizionare le provette in un amplificatore (termostato) a 37 ° C per 30 minuti. ATTENZIONE! In caso di utilizzo di amplificatori con un sistema di rilevamento "in tempo reale" per la trascrizione inversa, è necessario programmare il dispositivo per eseguire il programma appropriato (vedere la Tabella 2 e "Linee guida per l'uso di un kit di reagenti per rilevare e differenziare i genotipi del virus dell'epatite C (HCV)) in materiale clinico con il metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) con rilevazione di ibridizzazione-fluorescenza "AmpliSense HCV-genotipo-FL" ", sviluppato dall'Istituto centrale di ricerca epidemiologica di Epidemiologia Rospotrebnadzor). Tabella 2 4 I volumi dei reagenti introdotti sono dati tenendo conto del numero dei campioni studiati (campioni clinici e 1 controllo dello stadio di estrazione dell'RNA) e della riserva per 1 campione. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 16 di 32

17 FRT FORMAT Programma per eseguire la reazione di trascrizione inversa per amplificatori con un sistema di rilevamento in tempo reale 5 Step Temperatura, C Durata della fase Misura della fluorescenza Numero di cicli min 1 2. Dopo la fine della reazione, aggiungere 20 μl di tampone DNA alle provette utilizzando un nuovo punta del filtro per ogni campione. Miscelare delicatamente su un vortice e far precipitare le gocce dal cappuccio della fiala. La cdna ottenuta nella reazione di trascrizione inversa viene utilizzata per l'amplificazione PCR. La preparazione di CDna finita può esser immagazzinata a una temperatura non più in alto che meno 16 С per 1 settimana o a una temperatura non più in alto che meno 68 С durante un anno. CONDUZIONE DELL'AMPLIFICAZIONE CON IL RILEVAMENTO NELLA MODALITÀ IN TEMPO REALE A. Preparazione dei tubi di amplificazione La scelta dei tubi per l'amplificazione dipende dall'amplificatore utilizzato. Per l'inserimento di reagenti, campioni di CDna e campioni di controllo in provette, vengono utilizzati puntali monouso con filtri. Il volume totale della miscela di reazione è 25 μl, incluso un volume campione di cdna 10 μl. ATTENZIONE! I componenti della miscela di reazione devono essere miscelati immediatamente prima di condurre studi sulla PCR. I reagenti di miscelazione basati sul numero richiesto di reazioni, compreso il test del test e dei campioni di controllo, sono necessari secondo la tabella di calcolo (vedere le tabelle 3, 4). A1. Preparazione dei tubi di amplificazione utilizzando il kit PCR; versione FRT-g1-4 5 Ad esempio, Rotor-Gene 3000 o 6000 (Corbett Research, Australia); Rotor-Gene Q (Qiagen, Germania); iq5 (Bio-Rad, Stati Uniti); Mx3000P (Stratagene, Stati Uniti); "DT-96" ("DNA-technology", Russia) e raccomandato dall'Istituto centrale di ricerca epidemiologica di Rospotrebnadzor FBUN nelle linee guida per l'uso di questo kit di reagenti. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 17 di 32

18 FORMATO FRT 1. Prima di iniziare a lavorare, scongelare, agitare accuratamente tutti i reagenti del kit e far precipitare le gocce dai tappi delle provette. 2. Selezionare il numero richiesto di provette di amplificazione, tenendo conto del numero di campioni di test e di controllo (un controllo dell'estrazione dell'RNA, due controlli dell'amplificazione). Tipo di tubi da scegliere in base al dispositivo utilizzato. ATTENZIONE! Ogni campione viene analizzato usando tre miscele di reazione, quindi per ciascun campione è necessario preparare 3 provette. Quando si utilizzano dispositivi di tipo rotativo, contrassegnare le provette "sample_1b / 3a", "sample_1a / 2" e "sample_vko / 4", rispettivamente. Quando si utilizzano dispositivi tablet, utilizzare un treppiede contrassegnato per questo scopo. 3. Selezionare tre provette da 0,5 ml per la preparazione delle miscele di reazione. Etichettare i tubi "1b / 3a", "1a / 2" e "VKO / 4". 4. A ciascuna delle tre provette destinate alla preparazione delle miscele di reazione, aggiungere fino a 1 reazione: 5 μl di miscela RT-PCR-2-FEP / FRT, 0,5 μl di polimerasi (TaqF) e 10 μl della corrispondente miscela PCR Il genotipo HCV -1-FRT (vedi anche Tabella 3), la PCR mix-1-FRT dei genotipi HCV 1b / 3a introdotta nella provetta "1b / 3a", ecc. Mescolare le miscele di reazione risultanti su un vortice e far precipitare le gocce dal cappuccio della fiala. ATTENZIONE! Le miscele di reazione devono essere preparate con un margine di 1 campione (vedere Tabella 3). 5. Aggiungere ai tubi destinati all'amplificazione, 15 μl della miscela di reazione finita secondo l'etichetta, ad es. la miscela di reazione "1b / 3a" viene introdotta nelle provette etichettate "sample_1b / 3a", ecc. 6. Aggiungere 10 μl di campioni di cdna ottenuti nella reazione di trascrizione inversa alle provette preparate con le miscele di reazione disperse in conformità con la marcatura e ciascun campione, compreso il controllo di estrazione negativo (OK), deve essere aggiunto a 3 provette contenenti le provette di reazione disperse. una miscela di "1b / 3a", "1a / 2" e "VKO / 4". 7. Mettere le reazioni di controllo: a) Aggiungere il controllo negativo della PCR (K) alle provette con le miscele di reazione scavate 1b / 3a, 1a / 2 e BKO / 4 di 10 μl di tampone TE. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 18 di 32

19 FRT FORMAT b) controllo positivo della PCR (K + 1b / 3a) in una provetta con la miscela di reazione "1b / 3a", aggiungere 10 μl di OTP cdna genotipi HCV 1b / 3a; c) controllo positivo della PCR (K + 1a / 2) in una provetta con la miscela di reazione "1a / 2" aggiungere 10 μl di OTP cdna genotipi HCV 1a / 2; d) controllo positivo della PCR (K + VKO / 4) in una provetta con la miscela di reazione VKO / 4. aggiungere 10 μl di PKO cdna HCV EKO / genotipo 4. Schema di preparazione delle miscele di reazione per la variante FRT Volume del reagente per reazione (μl) Numero Numero campioni di ricerca clinica di punti 6,00 5,00 0,50 Numero di campioni clinici + 1 controllo della fase di estrazione di RNA + 2 controllo PCR (N + 3, N numero di campioni clinici). Genotipo PCR mix-1-FRT HCV * RT-PCR mix-2-FEP / FRT * Tabella 3 Polimerasi (TaqF) *,,,,,,,,,, 0 * I volumi di reagenti applicati sono indicati con un margine di 1 campione. A2. Preparazione delle provette di amplificazione utilizzando il kit "kit PCR" versione FRT-g Prima di iniziare il lavoro, scongelare, miscelare accuratamente tutti i reagenti del kit sul vortice e far precipitare le goccioline dai cappucci dei tubi. 2. Selezionare il numero richiesto di provette di amplificazione, tenendo conto del numero di campioni di test e di controllo (un controllo dell'estrazione dell'RNA, due controlli dell'amplificazione). Tipo di tubi da scegliere in base al dispositivo utilizzato. ATTENZIONE! Ogni campione viene analizzato usando quattro miscele di reazione, quindi per ogni campione è necessario preparare 4 provette. Quando si usano tubi con un volume di 0,2 ml per strumenti del tipo a rotore, contrassegnare le provette "specimen_1b / 3a", "specimen_1a / 2", "specimen_vko / 4" e "specimen_5a / 6", rispettivamente. Quando si utilizzano dispositivi di tipo tablet o quando si utilizza il striped striping 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 19 di 32

20 tubi FRT FORMAT per strumenti rotanti utilizzano un treppiede contrassegnato per questo scopo. 3. Selezionare quattro provette da 0,5 ml per la preparazione delle miscele di reazione. Etichettare i tubi "1b / 3a", "1a / 2", "VKO / 4" e "5a / 6". 4. A ciascuna delle quattro provette destinate alla preparazione delle miscele di reazione, aggiungere fino a 1 reazione: 5 μl di genotipo RT-PCR mix-2- FRT HCV (vedere anche Tabella 4), con PCR mix-1- I genotipi HCT FRT 1b / 3a sono introdotti nella provetta "1b / 3a", ecc. Mescolare le miscele di reazione risultanti su un vortice e far precipitare le gocce dal cappuccio della fiala. Schema per la preparazione di miscele di reazione per la variante FRT Numero di reagenti per reazione (μL) Numero Il numero di campioni di test clinici è 7,00 5,00 0,50 FEP / FRT, 0,5 μl di polimerasi (TaqF) e 10 μl della corrispondente miscela PCR -1- PCR mix-1-FRT HCV genotipo * RT-PCR mix-2- FEP / FRT * Tabella 4 Polimerasi (TaqF) *,,,,,,,,, 0 * quantità di reagenti aggiunti sono indicati con un margine di 1 campione 5. Aggiungere ai tubi destinati all'amplificazione, 15 μl della miscela di reazione finita secondo l'etichetta, ad es. la miscela di reazione "1b / 3a" viene introdotta nelle provette etichettate "sample_1b / 3a", ecc. In caso di utilizzo per la reazione dell'amplificazione dei tubi a strisce, le miscele di reazione devono essere introdotte secondo lo schema illustrato in Fig.1. 7 Il numero di campioni clinici + 1 controllo dello stadio di estrazione di RNA + 2 controllo PCR (N + 3, N numero di campioni clinici). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 20 di 32

21 FRT FORMAT 4 provette utilizzate per la produzione di un singolo campione clinico Miscela "1b / 3a" Miscela "1a / 2" Miscela "VKO / 4" Miscela "5a / 6" Miscela "1b / 3a" Miscela "1a / 2" Miscela BKO / 4 "Mixture" 5а / 6 "Figura 1. Schema per l'introduzione di miscele e campioni di reazione quando si usano tubi strip per PCR. 6. Aggiungere 10 μl di campioni di cdna ottenuti nella reazione di trascrizione inversa alle provette preparate con le miscele di reazione disperse in conformità con la marcatura e ciascun campione, compreso il controllo di estrazione negativo (OK), deve essere aggiunto a 4 provette contenenti la reazione sparsa una miscela di "1b / 3a", "1a / 2", "VKO / 4" e "5a / 6". 7. Mettere le reazioni di controllo: a) aggiungere il controllo negativo della PCR (K) alle provette con le miscele di reazione tampone TE 1b / 3a, 1a / 2, VKO / 4 e 4a / 6a 10 μl. b) controllo positivo della PCR (K + 1b / 3a) in una provetta con la miscela di reazione "1b / 3a" aggiungere 10 μl di OTP cdna genotipi HCV 1b / 3a; c) controllo positivo della PCR (K + 1a / 2) in una provetta con la miscela di reazione "1a / 2" aggiungere 10 μl di OTP cdna genotipi HCV 1a / 2; d) controllo positivo della PCR (K + VKO / 4) in una provetta con la miscela di reazione VKO / 4, aggiungere 10 μl di PKO cdna HCV VKO / genotipo 4; e) controllo positivo della PCR (K + 5a / 6) in una provetta con la miscela di reazione "5a / 6", aggiungere 10 μl di OTP cdna genotipi HCV 5a / 6. B. Esecuzione dell'amplificazione con rilevamento in modalità "tempo reale" 1. Programmare lo strumento (amplificatore con il sistema di rilevamento in modalità "tempo reale") per eseguire il programma di amplificazione appropriato e rilevare il segnale fluorescente "AmpliSens-1" (vedere Tabelle 5, 6 ). Tabella 5 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p 21 di 32

22 FRT FORMAT Programma Amplisens-1 per dispositivi rotativi 8 Temperatura, Durata Misura Quantità Fase C dello stadio di fluorescenza dei cicli Hold / Hold min 1 Temperature 95 5 s Ciclismo / s 5 Ciclismo 95 5 s Ciclismo 2 / FAM / Verde, s 40 Ciclo 2 JOE / Giallo s Tabella 6 Programma AmpliSens-1 per dispositivi tablet 9 e Smart Cycler II (Cepheid, USA) Punto Temperatura, Durata Numero di misurazione C dello stadio di fluorescenza dei cicli min (900 s 10 s) s 95 5 secondi con FAM, JOE / HEX / Cy con 2. Installare i tubi nelle celle del modulo di reazione del dispositivo. 3. Avviare l'esecuzione del programma di amplificazione con il rilevamento del segnale fluorescente. 4. Al termine del programma, procedere con l'analisi e l'interpretazione dei risultati. ANALISI E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L'analisi dei risultati viene effettuata utilizzando il software utilizzato dallo strumento per il rilevamento della PCR c in "tempo reale". Le curve di accumulo del segnale fluorescente vengono analizzate per il canale per il fluoroforo FAM (o simile) e il canale per il fluoroforo JOE (o simile). I risultati sono interpretati in base alla presenza (o assenza) di 8 Ad esempio, Rotor-Gene 3000 o 6000 (Corbett Research, Australia), Rotor-Gene Q (Qiagen, Germania). 9 Ad esempio, icycler iq5 (Bio-Rad, USA); Mx3000P, Mx3005 (Stratagene, Stati Uniti); "DT-96" ("DNA-Technology", Russia) e raccomandato dall'Istituto centrale di ricerca epidemiologica di Rospotrebnadzor FBUN nelle linee guida per l'uso di questo kit di reagenti. 10 Per il dispositivo Smart Cycler II (Cepheid, USA). 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 22 di 32

Il FORMATO FRT dell'intersezione della curva di fluorescenza con la linea di soglia impostata al livello appropriato determina la presenza (o assenza) per questo campione di CDna del valore del ciclo di soglia Ct nel grafico corrispondente nella tabella dei risultati. Il risultato dell'amplificazione del canale è considerato positivo se la curva di fluorescenza ha un tipico aspetto a S per la PCR in tempo reale, una volta attraversata con una linea di soglia nella regione di guadagno di fluorescenza significativo, negativa se non esiste una curva tipica e nessuna intersezione con la linea di soglia (nessun valore Ct o Cp) e dubbioso in tutti gli altri casi. La Tabella 7 mostra i canali mediante i quali vengono rilevati genotipi di HCV per ciascuna miscela di reazione. Tabella 7 Miscela di reazione "1b / 3a" "1a / 2" "VKO / 4" "5a / 6 11" Canale Genotipi rilevabili HCV FAM / Verde 1b 1a VKO 5a JOE / HEX / Giallo / Cy3 3a Registrazione dei risultati nei campioni di controllo Risultati Gli studi sulla PCR sono considerati affidabili se si ottengono risultati corretti per il superamento dei campioni di controllo in conformità con la tabella di valutazione dei risultati delle reazioni di controllo (vedere Tabella 8). 11 Incluso nel kit PCR è la variante FRT-g1-6. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 23 di 32

24 FRT FORMAT Miscela di reazione Controllo OK K K + 1b / 3a Risultati per i controlli di vari stadi del dosaggio PCR FAM / Verde Nessun valore Ct Valore Ct mancante Sotto il valore limite Tabella 8 "1b / 3a" "1a / 2" "BKO / 4 »" 5a / 6 "12 Risultati dell'amplificazione tramite JOE / HEX / Giallo / Canale Cy3 FAM / Verde JOE / HEX / Giallo / Cy3 FAM / Verde JOE / HEX / Giallo / Cy3 FAM / Verde JOE / HEX / Giallo / Cy3 Valore mancante Valore Ct mancante Ct Sotto il valore limite K + 1a / 2 * * Valore Ct mancante Valore Ct mancante Valore Ct mancante Valore Ct mancante Valore inferiore Ct Valore Ct mancante Manca Il valore Ct manca Il valore Ct manca Il valore Ct manca Il valore Ct manca Il valore Ct manca Il valore Ct manca * * * * * Sotto il valore limite Sotto il valore limite K + Vko / 4 * * * * * * * * Sotto il valore limite Sotto il valore soglia K + 5a / 6 * * * * * * * Questa miscela di reazione non è testata. * * Sotto il valore limite ATTENZIONE! I valori limite di Ct sono indicati nell'inserto del kit PCR. Registrazione dei risultati nei campioni clinici studiati Sotto il valore limite 1. Il genotipo HCV presente in questo campione viene stabilito confrontando i risultati dell'amplificazione in tre (per il kit PCR, variante FRT-g1-4) o quattro tubi (per il kit PCR opzione FRT-g1-6) in base alla tabella. 7, inoltre: a) Se il valore Ct per il campione è determinato per il campione, corrispondente a un singolo genotipo dell'HCV RNA, il risultato è "Genotype"; b) Se due o più valori Ct sono determinati per un campione nella tabella dei risultati, viene emesso un genotipo doppio, triplo ecc. Un'eccezione è il seguente caso: se i valori di Ct sono determinati per un campione sulla miscela di reazione VKO / 4 attraverso il canale JOE / HEX / Yellow / Cy3 (4 genotipo HCV) e sulla miscela di reazione 1b / 3a sul canale FAM / Green (1b HCV), e il valore Ct per il 4 ° genotipo è più di 10 valori Ct per il primo genotipo per 10 o più cicli, quindi 12 variante FRT-g1-6 è inclusa nel kit PCR. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 24 di 32

25 FRT FORMAT è il risultato di "Genotype 4". 2. Se nella tabella dei risultati per il campione, il valore Ct è determinato solo per CTP (reazione CTP / 4, canale FAM / verde) ed è inferiore al valore limite indicato nell'inserto, il risultato è "Il genotipo HCV non è determinato". Inoltre, se è noto che la concentrazione di HCV RNA in questo campione rientra nella sensibilità analitica del kit di reagenti, il risultato è dato "Il genotipo dell'HCV non è determinato a causa della bassa carica virale". 3. Se i risultati Ct per tutti i genotipi sono assenti nella tabella dei risultati per il campione, e il valore Ct per ASD (tramite il canale FAM su PCV mixes-1-FRT HCV EKO / genotipo 4) non è definito o supera il limite (indicato nell'inserto), È necessario ripetere lo studio PCR di questo campione, a partire dallo stadio di estrazione dell'RNA. ATTENZIONE! 1. Se il valore Ct in almeno un campione con un controllo positivo dello stadio di PCR (K + 1b / 3a, K + 1a / 2, K + VKO / 4 o K + 5a / 6) supera il valore limite specificato nell'inserto o è assente, è necessario ripetere il saggio PCR per tutti i campioni, a partire dalla fase di estrazione. 2. Se per il controllo negativo dell'estrazione dell'RNA (OC) almeno su una delle miscele di reazione "1b / 3a", "1a / 2", "5a / 6" lungo qualsiasi canale utilizzato e / o sulla miscela di reazione "VKO / 4" "Un segnale positivo viene rilevato sul canale JOE / HEX / Giallo / Cy3, è necessario ripetere lo studio PCR per tutti i campioni per i quali il genotipo HCV è stato determinato in questa miscela di reazione, a partire dalla fase di estrazione dell'RNA. 3. Se per un controllo PCR negativo (K) viene rilevato un segnale positivo su qualsiasi miscela di reazione lungo uno qualsiasi dei canali, è necessario ripetere lo studio PCR per tutti i campioni per i quali è stato determinato il genotipo HCV in questa miscela di reazione, a partire dalla fase di estrazione dell'RNA. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 25 di 32

26 SHELF LIFE, CONDIZIONI DI TRASPORTO E CONSERVAZIONE Data di scadenza. 12 mesi Il kit di reagenti scaduti non è applicabile. La durata di conservazione dei reagenti non coperti corrisponde alla durata indicata sulle etichette dei reagenti non aperti, salvo diversa indicazione nelle istruzioni. Trasporti. Un set di reagenti deve essere trasportato a una temperatura compresa tra 2 e 8 ° C per non più di 5 giorni. Al ricevimento, smontare in base alle temperature di conservazione specificate. Bagagli. Conservare i kit di reagenti "RIBO-sorb" e "RIBO-prep" a una temperatura compresa tra 2 e 8 ° C. Kit di reagenti REVERTA-L e "PCR kit", ad eccezione di OKO, TE-buffer e CTP STI-248-rec conservato a una temperatura non superiore a meno 16 ° C. EYE, TE-buffer e CTP STI-248-rec dal "kit PCR" devono essere conservati a una temperatura compresa tra 2 e 8 ° C. PCR mix-1-FRT HCV genotipi 1b / 3a, Genotipi HCV PCR mix-1-FRT 1a / 2, HCV BKO / genotipo PCR mix-1-FRT I genotipi HCV / genotipo 4 e PCR mix-1-FRT 5a / 6 devono essere conservati in un luogo buio. Condizioni di vacanza Per le istituzioni terapeutiche e profilattiche e sanitarie. I reclami sulla qualità del kit di reagenti AmpliSense HCV-genotipo-FL devono essere inviati all'impianto di produzione dell'Istituto federale di ricerca e sviluppo dell'Epidemiologia Rospotrebnadzor (Mosca, Novogireevskaya St., 3a) nel dipartimento per la bonifica e l'addestramento ("495), fax (495), È possibile lasciare recensioni e suggerimenti sui prodotti di AmpliSense compilando un profilo utente sul sito Web: 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / p.26 di 32

27 RNA ESTRAZIONE APPENDICE 1. Estrazione di RNA utilizzando il kit di reagenti RIBO-sorb.. Procedura 1. Soluzione di lisi e soluzione di lavaggio 1 (se conservata a 2-8 ° C), riscaldata a 60 ° C fino a completa dissoluzione dei cristalli. 2. Selezionare il numero richiesto di provette monouso da 1,5 ml (incluso il controllo di estrazione negativo). Etichettare le provette. 3. Nella parte inferiore di ogni provetta, preparare 10 μl di CTP STI-248-rec. 4. Aggiungere 450 μl di soluzione di lisi alle provette. Etichettare le provette. Nota Con un ampio volume di campioni per facilitare la procedura di selezione, è consentito miscelare in una fiala separata di soluzione litica e CTP STI-248-rec (per campione, 450 μl di soluzione di lisi e 10 μl di CTP STI-248-rec) seguita da separazione di 450 μl della miscela in provette pre-preparate da 1,5 ml. 5. Nelle provette con soluzione di lisi e ASD, preparare 100 μl di campione usando le punte con un filtro. In una provetta con controllo negativo (OK), aggiungere 100 μl di controllo negativo. 6. I campioni strettamente chiusi devono essere accuratamente miscelati sul vortice e centrifugati per 5 secondi a 5.000 giri / min in una microcentrifuga per rimuovere le gocce dalla superficie interna del cappuccio del tubo. 7. Risospendere il sorbente con il vortex vigoroso. Aggiungere 25 ml di assorbente risospeso in ogni provetta con una punta separata. 8. Mescolare il contenuto delle provette su un vortice e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente, mescolando accuratamente ogni 2 minuti. 9. Centrifugare le provette per microcentrifuga a 7 migliaia di g (ad esempio, 10 migliaia di giri per un MiniSpin, centrifuga Eppendorf) per 1 minuto. 10. Rimuovere il surnatante da ciascun tubo con una punta separata usando un aspiratore a vuoto. 11. Aggiungere 400 μl di soluzione di lavaggio alle provette 1. Vortex fino a quando il sorbente non è completamente risospeso. Centrifugare i tubi in una microcentrifuga a 7 migliaia di g per 1 minuto. Selezionare il sovranatante 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 27 di 32

28 RNA ESTRAZIONE da ciascun tubo con una punta separata usando un aspiratore a vuoto. 12. Aggiungere 500 μl di soluzione di lavaggio alle provette 3. Vortex finché l'assorbente non è completamente risospeso. Centrifugare i tubi in una microcentrifuga a 7 migliaia di g per 1 minuto. Rimuovere la soluzione di lavaggio 3 da ciascun tubo con una punta separata usando un aspiratore a vuoto. 13. Aggiungere 400 μl di soluzione di lavaggio alle provette 4. Vortex finché l'assorbente non è completamente risospeso. Centrifugare i tubi in una microcentrifuga a 7 migliaia di g per 1 minuto. Selezionare completamente la soluzione di lavaggio 4 da ciascun tubo con una punta separata usando un aspiratore a vuoto. 14. Asciugare l'assorbente mettendo le provette con i cappucci aperti in un termostato a 60 ° C per 15 minuti. 15. Risospendere il sorbente in 50 μl di tampone di RNA. Riscaldare in un termostato a 60 ° C per 2 minuti, miscelare su un vortice e far precipitare il sorbente in una centrifuga a 12.000 g (ad esempio, rpm per una centrifuga MiniSpin, Eppendorf) per 1 minuto. ATTENZIONE! La preparazione risultante di RNA non può essere conservata, la reazione di trascrizione inversa deve essere eseguita immediatamente dopo aver ricevuto il campione di RNA. È necessario selezionare la soluzione di RNA per la reazione con molta attenzione, senza catturare il sorbente. Se il sorbente è agitato, è necessario farlo precipitare in una centrifuga. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 28 di 32

29 APPENDICE PER L'ESTRAZIONE DEL RNA 2. Estrazione dell'RNA usando il kit di reagenti RIBO-Preparazione Procedura 1. La soluzione di lisi (se conservata a una temperatura compresa tra 2 e 8 ° C) viene riscaldata a una temperatura fino a 65 ° C fino alla completa dissoluzione dei cristalli. 2. Selezionare il numero richiesto di provette monouso da 1,5 ml (compresi i controlli di estrazione negativi e positivi). 3. Nella parte inferiore di ogni provetta, preparare 10 μl di CTP STI-248-rec. 4. Aggiungere 300 μl della soluzione di lisi alle provette. Etichettare le provette. Nota Con un ampio volume di campioni per facilitare la procedura di assegnazione, è consentito miscelare in una fiala separata la soluzione di lisi e CTP STI-248-rec (per campione μl, 300 μl della soluzione per lisi e 10 μl CTP STI-248-rec), seguito da 300 μl della miscela in provette da 1,5 ml pre-preparate. 5. In provette con una soluzione per lisi ed EKR, aggiungere 100 μl di ciascun campione usando le punte con un filtro. In una provetta con controllo negativo (OK), aggiungere 100 μl di controllo negativo. 6. Agitare su vortex il contenuto dei tubi, centrifugare per 5 secondi in una microcentrifuga per rimuovere le goccioline dalla superficie interna del coperchio e riscaldare per 5 minuti a 65 ° C in un termostato. 7. Aggiungere 400 μl di soluzione di precipitazione alle provette, mescolare accuratamente su un vortice. 8. Centrifugare le provette per microcentrifuga a 12.000 g (ad esempio, rpm per una centrifuga MiniSpin, Eppendorf) per 5 minuti. 9. Rimuovere con cautela il supernatante, senza toccare il sedimento, utilizzando un dispositivo di aspirazione a vuoto e una punta separata per ciascun campione. 10. Aggiungere 500 μl di soluzione di lavaggio alle provette 3, chiudere saldamente i coperchi, risciacquare accuratamente il sedimento, ruotando le provette 3-5 volte. È possibile eseguire la procedura simultaneamente per tutti i tubi, per questo è necessario coprire i tubi in un rack con un coperchio o un altro treppiede in cima, premerli e ruotare il treppiede. 11. Centrifugare a 12 migliaia di g per 1-2 minuti in una microcentrifuga. 12. Con cautela, senza catturare il sedimento, selezionare il supernatante, 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 29 di 32

30 RNA EXTRACTION usando un aspiratore a vuoto e una punta separata per ogni campione. 13. Aggiungere ai tubi 200 μl di soluzione di lavaggio 4, chiudere saldamente i coperchi e sciacquare accuratamente il precipitato, ruotando le provette 3-5 volte. È possibile eseguire la procedura simultaneamente per tutti i tubi, per questo è necessario coprire i tubi in un rack con un coperchio o un altro treppiede in cima, premerli e ruotare il treppiede. 14. Centrifugare a 12 migliaia di g per 2 minuti in una microcentrifuga. 15. Con attenzione, senza catturare il sedimento, selezionare attentamente il surnatante usando un aspiratore a vuoto e una punta separata per ogni campione. 16. Mettere le provette in un termostato a 65 ° C per 5 minuti per asciugare il precipitato (i tappi dei tubi devono essere aperti). 17. Aggiungere 50 μl di tampone di RNA alle provette. Mescola il vortice. Mettere in un termostato a 65 ° C per 5 minuti, agitando di tanto in tanto su un vortice. 18. Centrifugare le provette a 12000 g per 1 minuto in una microcentrifuga. Il supernatante contiene RNA purificato. I campioni sono pronti per la formulazione della reazione di trascrizione inversa e PCR. ATTENZIONE! La preparazione risultante di RNA non può essere conservata, la reazione di trascrizione inversa deve essere eseguita immediatamente dopo aver ricevuto il campione di RNA. 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 30 di 32

31 SIMBOLI UTILIZZATI IN PRODOTTO STAMPATO Numero di catalogo Codice di lotto Attenzione! Fare riferimento alla documentazione allegata Numero massimo di test Prodotto per diagnostica in vitro Utilizzo fino a Data di modifica Limite di temperatura Limite superiore di temperatura Consultare il manuale di istruzioni Evitare la luce solare diretta Data di produzione Produttore 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) 31 di 32

32 Rev. LA IvI Dove fare le modifiche Piè di pagina Piè di pagina Elenco delle modifiche L'essenza delle modifiche Numero di catalogo aggiunto R-V1-G (1-4) - 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) per la configurazione del modulo 3 Numeri di catalogo rimossi per forme di configurazioni 1 e 4 2x (RG, iQ, Mx, Dt, SC) / VER / pagina 32 di 32

Amplisens hcv fl

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Fasi dell'epatite c
Prezzo Mpiviropack

Tutto sull'epatite C

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Trattamento, sintomi, droghe

Epatite con ampli rna hcv fl

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Epatite con ampli rna hcv fl

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L'epatite è una malattia infiammatoria acuta e cronica del fegato, non focale, ma diffusa. In epatite diversa, i metodi di infezione sono diversi, differiscono anche nel tasso di progressione della malattia, nelle manifestazioni cliniche, nei metodi e nelle prognosi della terapia. Anche i sintomi di diversi tipi di epatite sono diversi. Inoltre, alcuni sintomi appaiono più forti di altri, che è determinato dal tipo di epatite.

Sintomi principali

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  1. Yellowness. Il sintomo è comune e dovuto al fatto che la bilirubina entra nel sangue del paziente in caso di danno epatico. Il sangue, che circola attraverso il corpo, lo diffonde attraverso gli organi e i tessuti, dipingendoli di giallo.
  2. L'aspetto del dolore nel giusto ipocondrio. Si verifica a causa dell'aumento delle dimensioni del fegato, che porta alla comparsa di dolore, che è opaco e prolungato o di natura parossistica.
  3. Il deterioramento della salute, accompagnato da febbre, mal di testa, vertigini, indigestione, sonnolenza e letargia. Tutto ciò è una conseguenza dell'azione sul corpo della bilirubina.

Epatite acuta e cronica

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I pazienti con epatite hanno forme acute e croniche. Nella forma acuta, si manifestano in caso di danno virale del fegato, e anche se ci sono stati avvelenamenti da vari tipi di veleni. Nelle forme acute della malattia, la condizione dei pazienti si deteriora rapidamente, il che contribuisce allo sviluppo accelerato dei sintomi.

Con questa forma della malattia sono possibili proiezioni favorevoli. Ad eccezione del suo diventare cronico. In forma acuta, la malattia è facilmente diagnosticata e più facile da trattare. L'epatite acuta non trattata si sviluppa facilmente in una forma cronica. A volte con avvelenamento grave (ad esempio, alcol), la forma cronica si verifica in modo indipendente. Nella forma cronica di epatite, si verifica il processo di sostituzione delle cellule del fegato con tessuto connettivo. È debolmente espresso, è lento e quindi a volte rimane non diagnosticato fino alla comparsa della cirrosi epatica. L'epatite cronica viene trattata peggio e la prognosi per la sua cura è meno favorevole. Nel decorso acuto della malattia, lo stato di salute è significativamente peggiorato, si manifesta ittero, appare intossicazione, diminuisce la funzione funzionale del fegato e aumenta il contenuto di bilirubina nel sangue. Con la rilevazione tempestiva e il trattamento efficace dell'epatite acuta, il paziente si riprende più spesso. Con una durata della malattia di oltre sei mesi, l'epatite diventa cronica. La forma cronica della malattia porta a gravi disturbi nel corpo: la milza e il fegato si ingrossano, il metabolismo è disturbato, si verificano complicazioni come la cirrosi epatica e le formazioni oncologiche. Se un paziente ha diminuito l'immunità, il regime di trattamento non è corretto o c'è dipendenza da alcol, quindi la transizione verso forme croniche di epatite minaccia la vita del paziente.

Varietà di epatite

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L'epatite ha diversi tipi: A, B, C, D, E, F, G, sono anche chiamati epatite virale, poiché la causa del loro verificarsi è il virus.

Questo tipo di epatite è anche chiamata malattia di Botkin. Ha un periodo di incubazione che dura da 7 giorni a 2 mesi. Il suo agente patogeno, il virus RNA, può essere trasmesso da una persona malata a una persona sana per mezzo di prodotti di bassa qualità e acqua, a contatto con oggetti domestici utilizzati dal paziente. L'epatite A è possibile in tre forme, sono divisi in base alla forza della manifestazione della malattia:

  • in forma acuta con ittero, il fegato è gravemente danneggiato,
  • con subacuto senza ittero, possiamo parlare di una versione più leggera della malattia,
  • nella forma subclinica, si può anche non notare i sintomi, anche se la persona infetta è la fonte del virus ed è in grado di contagiare gli altri.

Questa malattia è anche chiamata epatite sierica. Accompagnato da un aumento del fegato e della milza, la comparsa di dolore alle articolazioni, vomito, temperatura, danni al fegato. Si manifesta in forma acuta o cronica, che è determinata dallo stato dell'immunità del paziente. Modi di infezione: durante le iniezioni con violazione delle norme sanitarie, rapporti sessuali, durante le trasfusioni di sangue, l'uso di strumenti medici scarsamente disinfettati. La durata del periodo di incubazione è di 50 ÷ 180 giorni. L'incidenza dell'epatite B è ridotta usando la vaccinazione.

Questo tipo di malattia è una delle malattie più gravi, in quanto è spesso accompagnata da cirrosi o cancro del fegato, che porta successivamente alla morte. La malattia è scarsamente suscettibile al trattamento e inoltre, una volta che ha avuto l'epatite C, una persona può essere reinfettata dallo stesso disturbo. Non è facile curare l'HCV: dopo la malattia acuta da epatite C, il 20% dei pazienti guarisce e nel 70% dei pazienti il ​​corpo non è in grado di curarsi dal virus e la malattia diventa cronica. Stabilire la ragione per cui alcuni sono guariti, mentre altri non lo sono, non ha ancora avuto successo. La forma cronica dell'epatite C in sé non scomparirà e quindi deve essere trattata. La diagnosi e il trattamento della forma acuta dell'HCV sono effettuati da uno specialista di malattie infettive, la forma cronica della malattia è un epatologo o un gastroenterologo. È possibile essere infettati durante le trasfusioni di plasma o sangue da un donatore infetto, quando si usano strumenti medici di scarsa qualità, sessualmente, e la madre malata trasmette l'infezione al bambino. Il virus dell'epatite C (HCV) si sta rapidamente diffondendo in tutto il mondo, il numero di pazienti ha superato da tempo mezzo milione e mezzo di persone. In precedenza, l'HCV non rispondeva bene alla terapia, ma ora la malattia può essere curata usando antivirali moderni ad azione diretta. Solo questa terapia è piuttosto costosa e quindi non tutti possono permetterselo.

Questo tipo di epatite D è possibile solo quando è coinfettato con il virus dell'epatite B (la coinfezione è un caso di infezione di una singola cellula con virus di diverso tipo). È accompagnato da un massiccio danno epatico e da un decorso acuto della malattia. Modi d'infezione: portare il virus della malattia nel sangue di una persona sana da un trasportatore di virus o da una persona malata. Il periodo di incubazione dura 20 ÷ 50 giorni. Esteriormente, il decorso della malattia assomiglia all'epatite B, ma la sua forma è più grave. Può diventare cronico andando più tardi alla cirrosi. È possibile effettuare la vaccinazione, simile a quella usata per l'epatite B.

Leggermente reminiscente dell'epatite A dal corso e dal meccanismo di trasmissione, poiché è anche trasmessa attraverso il sangue allo stesso modo. La sua caratteristica è il verificarsi di forme fulminee, che causano la morte in un periodo non superiore a 10 giorni. In altri casi, può essere efficacemente curato e la prognosi per il recupero è spesso favorevole. Un'eccezione può essere la gravidanza, poiché il rischio di perdere un figlio è vicino al 100%.

Questo tipo di epatite non è stato studiato abbastanza. È noto solo che la malattia è causata da due diversi virus: uno è stato isolato dal sangue di donatori, il secondo è stato trovato nelle feci di un paziente che ha ricevuto l'epatite dopo una trasfusione di sangue. Segni: comparsa di ittero, febbre, ascite (accumulo di liquido nella cavità addominale), aumento delle dimensioni del fegato e della milza, aumento dei livelli di bilirubina ed enzimi epatici, comparsa di cambiamenti nelle urine e nelle feci, nonché intossicazione generale del corpo. Metodi efficaci di trattamento dell'epatite F non sono ancora stati sviluppati.

Questo tipo di epatite è simile all'epatite C, ma non così pericoloso in quanto non contribuisce allo sviluppo della cirrosi e del cancro del fegato. La cirrosi può verificarsi solo in caso di coinfezione di epatite G e C.

diagnostica

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Nei loro sintomi, l'epatite virale è simile l'una all'altra, proprio come alcune altre infezioni virali. Per questo motivo, è difficile stabilire la diagnosi esatta del paziente. Di conseguenza, al fine di chiarire il tipo di epatite e la corretta prescrizione della terapia, sono necessari esami del sangue di laboratorio per identificare i marcatori - indicatori che sono individuali per ciascun tipo di virus. Avendo identificato la presenza di tali marcatori e il loro rapporto, è possibile determinare lo stadio della malattia, la sua attività e il possibile esito. Al fine di tracciare la dinamica del processo, dopo un periodo di tempo l'esame viene ripetuto.

Come trattare l'epatite C

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Gli attuali regimi di trattamento per forme croniche di HCV sono ridotti alla terapia antivirale di combinazione, inclusi antivirali ad azione diretta come sofosbuvir, velpatasvir, daclatasvir e ledipasvir in varie combinazioni. A volte, la ribavirina e gli interferoni vengono aggiunti per migliorare la loro efficacia. Questa combinazione di sostanze attive blocca la replicazione dei virus, risparmiando il fegato dai loro effetti distruttivi. Questa terapia ha diversi svantaggi:

  1. Il costo dei farmaci per combattere il virus dell'epatite B è alto, non tutti possono ottenerli.
  2. L'accettazione dei singoli farmaci è accompagnata da spiacevoli effetti collaterali, tra cui febbre, nausea, diarrea.

La durata del trattamento delle forme croniche di epatite dura da diversi mesi a un anno, a seconda del genotipo del virus, del grado di danno all'organismo e dei farmaci utilizzati. Poiché l'epatite C colpisce principalmente il fegato, i pazienti sono tenuti a seguire una dieta rigorosa.

Caratteristiche dei genotipi dell'HCV

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L'epatite C è tra l'epatite virale più pericolosa. La malattia è causata da un virus contenente RNA, chiamato Flaviviridae. Il virus dell'epatite C è anche chiamato "killer affettuoso". Ha ricevuto un tale epiteto poco lusinghiero a causa del fatto che nella fase iniziale la malattia non è accompagnata da alcun sintomo. Non ci sono segni di ittero classico, e non vi è alcun dolore nella zona destra dell'ipocondrio. Rileva la presenza del virus non prima di un paio di mesi dopo l'infezione. E prima, la reazione del sistema immunitario è completamente assente ed è impossibile rilevare i marcatori nel sangue, e quindi non è possibile effettuare la genotipizzazione. Una caratteristica speciale dell'HCV è anche il fatto che, una volta entrato nel flusso sanguigno durante il processo di riproduzione, il virus inizia a mutare rapidamente. Tali mutazioni interferiscono con il sistema immunitario degli infetti per adattarsi e combattere la malattia. Di conseguenza, la malattia può durare per diversi anni senza sintomi, dopo di che la cirrosi o un tumore maligno appare quasi senza una fetta. E nell'85% dei casi, la malattia dalla forma acuta diventa cronica. Il virus dell'epatite C ha una caratteristica importante: una varietà di struttura genetica. Infatti, l'epatite C è una raccolta di virus, classificata in base alle varianti della loro struttura e suddivisa in genotipi e sottotipi. Un genotipo è la somma dei geni che codificano i tratti ereditati. Fino ad ora, 11 genotipi del virus dell'epatite C, che hanno i loro sottotipi, sono noti per la medicina. Il genotipo è indicato con numeri da 1 a 11 (sebbene negli studi clinici i genotipi siano principalmente utilizzati 1 ÷ 6), e sottotipi, usando le lettere dell'alfabeto latino:

In diversi paesi, i genotipi dell'HCV sono diffusi in modi diversi, ad esempio, in Russia, si può trovare il più spesso dal primo al terzo. La gravità della malattia dipende dal tipo di genotipo, determinano il regime di trattamento, la sua durata e il risultato del trattamento.

Come i ceppi HCV sono diffusi in tutto il pianeta

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Sul territorio del globo, i genotipi dell'epatite C sono distribuiti in modo eterogeneo, e più spesso i genotipi 1, 2, 3 possono essere trovati, e per i singoli territori appare così:

  • Nell'Europa occidentale e nelle regioni orientali, i genotipi 1 e 2 sono i più comuni,
  • negli Stati Uniti, sottotipi 1a e 1b,
  • Nell'Africa settentrionale, il genotipo 4 è il più comune.

A rischio di possibile infezione da HCV ci sono persone con disturbi del sangue (tumori del sistema ematopoietico, emofilia, ecc.), Nonché pazienti sottoposti a trattamento nelle unità di dialisi. Il genotipo 1 è considerato il più comune al mondo e rappresenta

50% del numero totale di casi. Il secondo più comune è il genotipo 3 con poco più del 30%. La diffusione dell'HCV in tutta la Russia presenta differenze significative rispetto alla versione mondiale o europea:

  • account genotype 1b per

50% dei casi

  • sul genotipo 3a

    20%

  • epatite 1a infetto

    10% dei pazienti

  • epatite con genotipo 2 trovata in

    Ma non solo la difficoltà della terapia HCV dipende dal genotipo. I seguenti fattori influenzano anche l'efficacia del trattamento:

    • età dei pazienti. La possibilità di una cura è molto più alta per i giovani
    • le donne sono più facili da recuperare rispetto agli uomini
    • il grado di danno epatico è importante - il risultato favorevole è più alto con meno danni,
    • l'entità della carica virale - minore è il virus nel corpo al momento del trattamento, più efficace è la terapia,
    • peso del paziente: più è alto, più è complicato il trattamento.

    Pertanto, il regime di trattamento viene scelto dal medico curante, in base ai fattori sopra elencati, genotipizzazione e raccomandazioni del EASL (Associazione europea per le malattie del fegato). EASL mantiene costantemente aggiornate le sue raccomandazioni e, quando appaiono nuovi farmaci efficaci per il trattamento dell'epatite C, correggono i regimi raccomandati.

    Chi è a rischio di infezione da HCV?

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    Come è noto, il virus dell'epatite C viene trasmesso attraverso il flusso sanguigno e quindi è più probabile che si infetti:

    • pazienti trasfusi
    • pazienti e clienti negli studi dentistici e nelle istituzioni mediche, dove gli strumenti medici sono sterilizzati in modo improprio,
    • a causa di strumenti non sterili, può essere pericoloso visitare unghie e saloni di bellezza,
    • Gli amanti del piercing e del tatuaggio possono anche soffrire di strumenti scarsamente trattati,
    • c'è un alto rischio di infezione per chi usa i farmaci a causa dell'uso ripetuto di aghi non sterili,
    • il feto può essere infetto da una madre infetta da epatite C,
    • durante i rapporti sessuali, l'infezione può anche entrare nel corpo di una persona sana.

    Qual è il trattamento dell'epatite C?

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    Il virus dell'epatite C è stato considerato un virus killer "tenero" per un motivo. È in grado di non mostrarsi per anni, dopo di che appare all'improvviso sotto forma di complicazioni accompagnate da cirrosi o cancro del fegato. Dopo tutto, più di 177 milioni di persone nel mondo hanno diagnosticato l'HCV. Il trattamento, che è stato utilizzato fino al 2013, iniezioni combinate di inetferferone e ribavirina, ha dato ai pazienti una possibilità di guarigione, non superiore al 40-50%. E inoltre, è stato accompagnato da effetti collaterali gravi e dolorosi. La situazione è cambiata nell'estate del 2013 dopo che la società farmaceutica statunitense Gilead Sciences ha brevettato la sostanza sofosbuvir, prodotta come farmaco con il marchio Sovaldi, che comprendeva 400 mg del farmaco. È diventato il primo farmaco antivirale ad azione diretta (DAA) a combattere l'HCV. I risultati degli studi clinici su sofosbuvir hanno soddisfatto i medici con le prestazioni, che hanno raggiunto l'85 ÷ 95% a seconda del genotipo, mentre la durata del corso della terapia rispetto al trattamento con interferoni e ribavirina è stata più che raddoppiata. E sebbene la società farmaceutica Gilead abbia brevettato sofosbuvir, è stata sintetizzata nel 2007 da Michael Sofia, un dipendente di Pharmasett, successivamente acquisito da Gilead Sciences. Dal nome di Michael, la sostanza sintetizzata da lui era chiamata sofosbuvir. Michael Sophia stesso, insieme a un gruppo di scienziati che ha fatto una serie di scoperte che hanno rivelato la natura dell'HCV, che gli ha permesso di creare un farmaco efficace per il suo trattamento, ha ricevuto il premio Lasker-DeBakey per la ricerca medica clinica. Bene, quasi tutti i profitti derivanti dalla vendita di un nuovo prodotto efficace sono andati a Gilead, che ha fissato prezzi monopolistici elevati su Sovaldi. Inoltre, la società ha difeso il suo sviluppo con un brevetto speciale, secondo il quale Gilead e alcune delle sue società partner sono diventate titolari del diritto esclusivo di produrre i DAA originali. Di conseguenza, i profitti di Gilead nei primi due anni di vendita del farmaco hanno coperto ripetutamente tutti i costi sostenuti dalla società per l'acquisto di Pharmasett, ottenendo un brevetto e successivi studi clinici.

    Cos'è sofosbuvir?

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    L'efficacia di questo farmaco nella lotta contro l'HCV era così alta che ora quasi nessun regime di trattamento può fare a meno del suo uso. Sofosbuvir non è raccomandato per l'uso come monoterapia, ma se usato in combinazione, mostra risultati eccezionalmente buoni. Inizialmente, il farmaco è stato usato in combinazione con ribavirina e interferone, che ha reso possibile nei casi non complicati ottenere una cura in sole 29 settimane. E questo nonostante il fatto che solo la terapia con interferone e ribavirina fosse due volte meno efficace e la sua durata a volte superasse le 40 settimane. Dopo il 2013, ogni anno successivo ha portato la notizia dell'emergere di un numero sempre maggiore di nuove medicine che combattono con successo il virus dell'epatite C:

    • Nel 2014 è apparso Daclatasvir
    • Il 2015 è stato l'anno di nascita di Ledipasvir,
    • Il 2016 ha deliziato la creazione di velpatasvir.

    Daclatasvir è stato rilasciato da Bristol-Myers Squibb nella forma del farmaco Daklinza, contenente 60 mg di ingrediente attivo. Le seguenti due sostanze sono state create dagli scienziati di Gilead e, poiché nessuna di esse era adatta alla monoterapia, hanno usato farmaci solo in combinazione con sofosbuvir. Per facilitare la terapia, i farmaci prudentemente ricreati rilasciati immediatamente in combinazione con sofosbuvir. Quindi c'erano droghe:

    • Harvoni, che combina sofosbuvir 400 mg e ledipasvir 90 mg,
    • Epclusa, che comprendeva sofosbuvir 400 mg e velpatasvir 100 mg.

    Nel trattamento con daclatasvir, sono stati presi due diversi farmaci, Sovaldi e Daclins. Ciascuna delle combinazioni accoppiate di principi attivi è stata utilizzata per trattare determinati genotipi di HCV secondo i regimi di trattamento raccomandati dall'EASL. E solo la combinazione di sofosbuvir con velpatasvir si è rivelata essere pangenotipica (universale). Epclus ha curato tutti i genotipi dell'epatite C con praticamente la stessa alta efficienza di circa il 97 ÷ 100%.

    L'emergere di generici

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    Gli studi clinici hanno confermato l'efficacia del trattamento, ma tutti questi farmaci altamente efficaci hanno avuto un grave svantaggio: prezzi troppo alti, che non hanno permesso loro di acquisire la maggior parte dei malati. I prezzi monopolisticamente alti dei prodotti installati da Gilead provocarono indignazione e scandali, costringendo i titolari di brevetti a fare alcune concessioni, dando ad alcune società di licenze di India, Egitto e Pakistan la produzione di analoghi (generici) di tali farmaci efficaci e ricercati. Inoltre, la lotta contro i detentori dei brevetti, offrendo farmaci per il trattamento a prezzi gonfiati in modo non oggettivamente, ha portato l'India, come paese in cui milioni di pazienti con epatite C vivono in una forma cronica. Come risultato di questa lotta, Gilead ha rilasciato licenze e sviluppi di brevetti a 11 società indiane per la prima versione indipendente di sofosbuvir, e quindi i loro altri nuovi prodotti. Dopo aver ottenuto le licenze, i produttori indiani hanno iniziato rapidamente a produrre generici, assegnando i loro marchi ai farmaci fabbricati. È così che è apparsa prima la generica Sovaldi, poi Daklinza, Harvoni, Epclusa e l'India sono diventati il ​​leader mondiale nella loro produzione. Secondo l'accordo di licenza, i produttori indiani pagano il 7% dei loro guadagni a favore dei titolari dei brevetti. Ma anche con questi pagamenti, il costo dei farmaci generici prodotti in India era dieci volte inferiore a quello degli originali.

    Meccanismi d'azione

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    Come riportato in precedenza, i regimi di trattamento dell'HCV emergenti sono correlati ai DAA e agiscono direttamente sul virus. Mentre precedentemente utilizzato per il trattamento di interferone con ribavirina ha rafforzato il sistema immunitario umano, aiutando il corpo a resistere alla malattia. Ciascuna delle sostanze agisce sul virus a modo suo:

    1. Sofosbuvir blocca la RNA polimerasi, inibendo così la replicazione virale.
    1. Daclatasvir, ledipasvir e velpatasvir sono inibitori NS5A che prevengono la diffusione di virus e la loro penetrazione in cellule sane.

    Un tale effetto direzionale consente di combattere con successo l'HCV, utilizzando sofosbuvir in combinazione con daklatasvir, ledipasvir, velpatasvir per la terapia. A volte, per migliorare l'effetto sul virus, un terzo componente viene aggiunto alla coppia, il più delle volte ribavirina.

    Produttori generici dall'India

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    Le compagnie farmaceutiche del paese hanno approfittato delle licenze loro concesse, e ora l'India sta rilasciando i seguenti generici Sovaldi:

    • Hepcvir - produttore Cipla Ltd.,
    • Hepcinat - Natco Pharma Ltd.,
    • Cimivir - Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • MyHep è un produttore di Mylan Pharmaceuticals Private Ltd.,
    • SoviHep - Zydus Heptiza Ltd.,
    • Sofovir è un produttore di Hetero Drugs Ltd.,
    • Resof - prodotto da Dr Reddy # 8217, s Laboratories,
    • Virso - rilascia Strides Arcolab.

    Gli analoghi Daklins sono prodotti anche in India:

    • Natdac di Natco Pharma,
    • Dacihep di Zydus Heptiza,
    • Daclahep da droghe etero,
    • Dactovin di Strides Arcolab,
    • Daclawin di Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • Mydacla di Mylan Pharmaceuticals.

    A seguito di Gilead, i produttori di farmaci indiani hanno anche padroneggiato la produzione di Harvoni, che ha prodotto i seguenti generici:

    • Ledifos - Uscite etero
    • Hepcinat LP - Natco,
    • Myhep LVIR - Mylan,
    • Hepcvir L - Cipla Ltd.,
    • Cimivir L - Biocon ltd. # 038, Hetero Drugs Ltd.,
    • LediHep - Zydus.

    E nel 2017, la produzione dei seguenti generici indiani Epclusi è stata dominata:

    • Velpanat ha rilasciato Natco Pharma,
    • Velasof ha dominato le droghe etero,
    • SoviHep V ha iniziato a produrre la società Zydus Heptiza.

    Come potete vedere, le case farmaceutiche indiane non sono in ritardo rispetto ai produttori americani, abbastanza rapidamente padroneggiando i nuovi farmaci, rispettando tutte le caratteristiche qualitative, quantitative e terapeutiche. Resistendo alla bioequivalenza farmacocinetica in relazione agli originali.

    Requisiti generici

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    Un farmaco generico è un farmaco in grado di sostituire il trattamento con costosi farmaci originali con un brevetto in termini di proprietà farmacologiche di base. Possono essere rilasciati sia quando sono disponibili, sia quando non c'è una licenza, solo la sua presenza rende l'analogo emesso in licenza. Nel caso di rilascio di licenze a società farmaceutiche indiane, Gilead ha anche fornito loro tecnologie di produzione, dando ai licenziatari il diritto a politiche di prezzo indipendenti. Affinché un analogo di un farmaco possa essere considerato un generico, deve rispettare un numero di parametri:

    1. È necessario rispettare il rapporto tra i componenti farmaceutici più importanti nella preparazione di standard qualitativi e quantitativi.
    1. Seguire gli standard internazionali pertinenti.
    1. È richiesta una conformità obbligatoria con condizioni di produzione adeguate.
    1. Nei preparati deve essere mantenuto un equivalente appropriato dei parametri di assorbimento.

    Vale la pena notare che l'OMS è di guardia per garantire la disponibilità di farmaci, che cerca di sostituire costosi farmaci di marca con l'aiuto di generici di bilancio.

    Soferbuvir generico egiziano

    A differenza dell'India, le compagnie farmaceutiche egiziane non sono diventate leader mondiali nella produzione di farmaci generici per l'epatite C, sebbene abbiano anche padroneggiato la produzione di analoghi sofosbuvir. Tuttavia, nella maggior parte dei loro analoghi non sono autorizzati:

    • MPI Viropack, produce il farmaco Marcyrl Pharmaceutical Industries # 8229, uno dei primissimi generici egiziani,
    • Heterosofir, pubblicato da Pharmed Healthcare. È l'unica licenza generica in Egitto. Sulla confezione, sotto l'ologramma, è nascosto un codice che consente di verificare l'originalità della preparazione sul sito Web del produttore, escludendo quindi la sua contraffazione,
    • Grateziano, prodotto da Pharco Pharmaceuticals,
    • Sofolanork, prodotto da Vimeo,
    • Sofocivir, prodotto da ZetaPhar.

    Generici per combattere l'epatite dal Bangladesh

    Il Bangladesh è un altro paese che produce generici contro l'HCV in grandi volumi. Inoltre, questo paese non ha nemmeno bisogno di licenze per la produzione di analoghi di farmaci di marca, dal momento che entro il 2030 le sue compagnie farmaceutiche sono autorizzate a rilasciare tali preparazioni mediche senza la presenza di documenti di licenza adeguati. Il più famoso e dotato della più recente tecnologia è la società farmaceutica Beacon Pharmaceuticals Ltd. Il progetto della sua capacità produttiva è stato creato da esperti europei e conforme agli standard internazionali. Beacon rilascia i seguenti farmaci generici per il trattamento del virus dell'epatite C:

    • Soforal - sofosbuvir generico, contiene il principio attivo 400 mg. A differenza della confezione tradizionale in flaconi da 28 pezzi, Sophoral viene prodotto sotto forma di blister da 8 compresse in un'unica piastra,
    • Daclavir è un generico di Daclatasvir, una compressa del farmaco contiene 60 mg della sostanza attiva. Viene anche prodotto sotto forma di blister, ma ogni disco contiene 10 compresse,
    • Sofosvel è un Epclusa generico, contiene sofosbuvir 400 mg e velpatasvir 100 mg. Farmaco pangenotipico (universale), efficace nel trattamento dei genotipi dell'HCV 1 ÷ 6. E in questo caso non esiste un normale imballaggio in flacone, le compresse sono confezionate in blister da 6 pezzi in ciascuna piastra.
    • Darvoni è un farmaco complesso che combina sofosbuvir 400 mg e daclatasvir 60 mg. Se necessario, combinare la terapia con sofosbuvir con daklatasvir, utilizzando farmaci di altri produttori, è necessario assumere una pillola di ciascun tipo. E Beacon li ha messi insieme in un'unica pillola. Darvoni è confezionato in blister da 6 compresse in un'unica piastra, inviati solo per l'esportazione.

    Al momento dell'acquisto di preparati da Beacon in base al corso della terapia, si dovrebbe prendere in considerazione l'originalità del loro imballaggio al fine di acquistare la quantità necessaria per il trattamento. Le più famose case farmaceutiche indiane Come accennato in precedenza, dopo che le compagnie farmaceutiche del paese ricevettero licenze per il rilascio di farmaci generici per la terapia HCV, l'India divenne il leader mondiale nella loro produzione. Ma tra la moltitudine di tutte le aziende, vale la pena di notare alcuni, i cui prodotti in Russia sono i più famosi.

    Natco Pharma Ltd.

    La più popolare è la società farmaceutica Natco Pharma Ltd., i cui farmaci hanno salvato la vita a molte decine di migliaia di persone affette da epatite cronica C. Ha padroneggiato la produzione di quasi tutta la linea di farmaci antivirali ad azione diretta, incluso sofosbuvir con daclatasvir e ledipasvir con velpatasvir. Natco Pharma è apparso nel 1981 a Hyderabad con un capitale iniziale di 3,3 milioni di rupie, quindi il numero di dipendenti era di 20 persone. Ora in India ci sono 3,5 mila persone che lavorano in cinque imprese Natco, e ci sono anche filiali in altri paesi. Oltre alle unità produttive, l'azienda dispone di laboratori ben attrezzati che consentono di sviluppare moderni preparati medici. Tra i suoi sviluppi, vale la pena notare che le droghe combattono il cancro. Uno dei farmaci più noti in questo settore, è Veenat, fabbricato dal 2003 e utilizzato per la leucemia. Sì, e il rilascio di farmaci generici per il trattamento del virus dell'epatite C è una priorità per Natco.

    Etero Drugs Ltd.

    Questa azienda ha fissato come obiettivo la produzione di generici, subordinando questa aspirazione alla propria rete di industrie, comprese le fabbriche con filiali e uffici con i laboratori. La rete di produzione di Hetero viene affinata per la produzione di farmaci su licenza ottenuti dalla società. Una delle sue attività è costituita da preparazioni mediche che consentono di combattere gravi malattie virali, il cui trattamento è diventato impossibile per molti pazienti a causa dell'elevato costo delle medicine originali. La licenza acquisita consente a Hetero di procedere prontamente al rilascio di farmaci generici, che vengono poi venduti ad un prezzo accessibile per i pazienti. La creazione di farmaci etero risale al 1993. Negli ultimi 24 anni, in India sono comparse una dozzina di fabbriche e decine di unità di produzione. La presenza di propri laboratori consente all'azienda di svolgere lavori sperimentali sulla sintesi di sostanze, che hanno contribuito all'espansione della base produttiva e all'esportazione attiva di droghe in paesi stranieri.

    Zydus heptiza

    Zydus è una società indiana che si è posta l'obiettivo di costruire una società sana, che, secondo i suoi proprietari, sarà seguita da un cambiamento per il migliore nella qualità della vita delle persone. L'obiettivo è nobile e, pertanto, per raggiungerlo, l'azienda svolge attività educative attive che riguardano le fasce più povere della popolazione. Incluso dalla vaccinazione gratuita della popolazione contro l'epatite B. Zidus in termini di volumi di produzione nel mercato farmaceutico indiano è al quarto posto. Inoltre, 16 dei suoi farmaci erano nella lista dei 300 farmaci più importanti dell'industria farmaceutica indiana. I prodotti Zydus sono richiesti non solo sul mercato interno, ma possono essere trovati nelle farmacie in 43 paesi del nostro pianeta. E la gamma di farmaci prodotti in 7 imprese supera gli 850 farmaci. Una delle sue industrie più potenti è nello stato del Gujarat ed è una delle più grandi non solo in India, ma anche in Asia.

    Terapia HCV 2017

    I regimi di trattamento dell'epatite C per ciascun paziente sono scelti individualmente dal medico. Per la corretta, efficace e sicura selezione dello schema, il medico deve sapere:

    • genotipo del virus
    • durata della malattia,
    • il grado di danno epatico,
    • presenza / assenza di cirrosi, infezione concomitante (ad esempio HIV o altra epatite), esperienza negativa di precedenti trattamenti.

    Dopo aver ricevuto questi dati dopo il ciclo di analisi, il medico seleziona l'opzione di trattamento ottimale in base alle raccomandazioni dell'EASL. Le raccomandazioni EASL vengono adeguate di anno in anno, aggiungono i nuovi farmaci emergenti. Prima di raccomandare nuove opzioni di trattamento, queste sono presentate per essere prese in considerazione dal Congresso o da un incontro speciale. Nel 2017, la riunione speciale EASL ha rivisto gli aggiornamenti dei programmi raccomandati a Parigi. È stato deciso di interrompere completamente la terapia con interferone in Europa per il trattamento dell'HCV. Inoltre, non c'era un singolo regime raccomandato utilizzando un singolo farmaco ad azione diretta. Ecco alcune opzioni di trattamento raccomandate. Tutti loro sono dati esclusivamente per la familiarizzazione e non possono diventare una guida per l'azione, dal momento che solo un medico può dare una prescrizione per la terapia, sotto la supervisione di cui successivamente sarà sottoposta.

    1. Possibili regimi di trattamento proposti da EASL in caso di monoinfezione da epatite C o co-infezione da HIV + HCV in pazienti senza cirrosi e non precedentemente trattati:
    • per il trattamento dei genotipi 1a e 1b, puoi usare:

    8229, sofosbuvir + ledipasvir, senza ribavirina, durata 29 settimane, 8229, sofosbuvir + daclatasvir, anche senza ribavirina, periodo di trattamento di 29 settimane, 8229, o sofosbuvir + velpatasvir senza ribavirina, la durata del corso è di 29 settimane.

    • nel trattamento del genotipo 2 viene utilizzato senza ribavirina per 29 settimane:

    # 8229, sofosbuvir + dklatasvir, 8229 o sofosbuvir + velpatasvir.

    • nel trattamento del genotipo 3 senza l'uso di ribavirina con un periodo di trattamento di 29 settimane, usare:

    # 8229, sofosbuvir + daclatasvir, 8229 o sofosbuvir + velpatasvir.

    • durante il trattamento del genotipo 4, è possibile richiedere la ribotirina entro 29 settimane:

    # 8229, sofosbuvir + ledipasvir, # 8229, sofosbuvir + daclatasvir, 8229 o sofosbuvir + velpatasvir.

    1. Regimi di trattamento EASL raccomandati per monoinfezione da epatite C o infezione concomitante da HIV / HCV in pazienti con cirrosi compensata che non sono stati precedentemente trattati:
    • per il trattamento dei genotipi 1a e 1b, puoi usare:

    8229, sofosbuvir + ledipasvir con ribavirina, durata 29 settimane, # 8229, o 24 settimane senza ribavirina, 8229 e un'altra opzione - 24 settimane con ribavirina con una prognosi sfavorevole di risposta, 8229, sofosbuvir + daclatasvir, se senza ribavirina, poi 24 settimane e con ribavirina, il periodo di trattamento è di 29 settimane, # 8229, o sofosbuvir + velpatasvir senza ribavirina, 29 settimane.

    8229, il sofosbuvir + dklatasvir senza ribavirina dura 29 settimane e con ribavirina, con una prognosi sfavorevole - 24 settimane, 8229 o sofosbuvir + velpatasvir senza combinazione con ribavirina per 29 settimane.

    # 8229, sofosbuvir + daclatasvir per 24 settimane con ribavirina, # 8229, o sofosbuvir + velpatasvir di nuovo con ribavirina, il periodo di trattamento è di 29 settimane, # 8229, come opzione sofosbuvir + velpatasvir è possibile 24 settimane, ma senza ribavirina.

    • Nel trattamento del genotipo 4, gli stessi regimi sono usati come nei genotipi 1a e 1b.

    Come potete vedere, oltre alla condizione del paziente e alle caratteristiche del suo corpo, anche la combinazione di farmaci prescritti scelti dal medico influisce sul risultato della terapia. Inoltre, la durata del trattamento dipende dalla combinazione scelta dal medico.

    Trattamento con farmaci HCV moderni

    Prendere pillole di droghe dirette l'azione antivirale prescritta da un medico per via orale una volta al giorno. Non sono divisi in parti, non masticano, ma vengono lavati con acqua normale. È meglio farlo allo stesso tempo, perché viene mantenuta una concentrazione costante di sostanze attive nel corpo. Non è necessario essere attaccati alle date di assunzione di cibo, la cosa principale è non farlo a stomaco vuoto. Quando inizi a prendere i farmaci, presta attenzione al tuo benessere, poiché durante questo periodo è più facile notare i possibili effetti collaterali. I PPPP stessi non ne hanno molti, mentre i farmaci prescritti nel complesso sono molto più piccoli. Molto spesso, gli effetti collaterali appaiono come:

    • mal di testa
    • vomito e vertigini,
    • debolezza generale
    • perdita di appetito
    • dolore articolare,
    • cambiamenti nei parametri bio-chimici del sangue, espressi in bassi livelli di emoglobina, diminuzione delle piastrine e dei linfociti.

    Gli effetti collaterali sono possibili in un piccolo numero di pazienti. Ma tutti uguali su tutti i disturbi notati devono essere notificati al medico curante per l'adozione delle misure necessarie. Al fine di evitare un aumento degli effetti collaterali, l'alcol e la nicotina dovrebbero essere esclusi dall'uso, poiché influenzano negativamente il fegato.

    Controindicazioni

    In alcuni casi, la ricezione dei DAA è esclusa, riguarda:

    • ipersensibilità individuale dei pazienti a determinati ingredienti dei farmaci,
    • pazienti di età inferiore ai 18 anni, in quanto non vi sono dati precisi sui loro effetti sul corpo,
    • donne che portano il feto e i bambini allattati al seno,
    • le donne dovrebbero usare metodi contraccettivi affidabili per evitare il concepimento durante il periodo di terapia. Inoltre, questo requisito si applica anche alle donne i cui partner ricevono anche terapia DAA.

    Conservare farmaci antivirali di azione diretta in luoghi inaccessibili per i bambini e l'azione della luce solare diretta. La temperatura di stoccaggio dovrebbe essere compresa tra 15 ÷ 30ºС. Iniziare a prendere i farmaci, controllare la loro fabbricazione e le date di conservazione indicate sulla confezione. Le droghe scadute sono proibite. Come ottenere DAA per i cittadini della Russia Sfortunatamente, i farmaci generici indiani non possono essere trovati nelle farmacie russe. La società farmaceutica Gilead, che fornisce licenze per il rilascio di farmaci, ha prudentemente vietato le loro esportazioni in molti paesi. Compreso in tutti gli stati europei. Coloro che vogliono acquistare generici indiani a basso costo per combattere l'epatite C possono trarre vantaggio da diversi modi:

    • ordinali attraverso le farmacie online russe e ricevi le merci in poche ore (o giorni) a seconda del luogo di consegna. E nella maggior parte dei casi, anche il pagamento anticipato non è richiesto,
    • ordinali attraverso negozi online indiani con consegna a domicilio. Qui avrete bisogno di un pagamento anticipato in valuta estera, e il tempo di attesa durerà da tre settimane a un mese. Inoltre, viene aggiunta la necessità di comunicare con il venditore in inglese,
    • andare in India e portare la droga da soli. Ci vorrà anche del tempo, oltre a una barriera linguistica, oltre alla difficoltà di verificare l'originalità dei prodotti acquistati in farmacia. A tutto ciò si aggiungerà il problema dell'autoesportazione, che richiederà un contenitore termico, la disponibilità del parere di un medico e una prescrizione in inglese, oltre a una copia dell'assegno.

    Interessati all'acquisto di farmaci, le persone decidono autonomamente quale delle possibili opzioni di consegna scegliere. Basta non dimenticare che nel caso dell'HCV, un esito favorevole della terapia dipende dalla velocità della sua insorgenza. Qui, nel senso letterale, il ritardo della morte è simile, e quindi non si dovrebbe ritardare l'inizio della procedura.